FD快速高爾基染色試劑盒

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注意：以下翻譯僅供參考，zui終使用者請以英文原文說明書為準！

FD Rapid GolgiStain^TM Kit

FD快速高爾基染色試劑盒

神經元和膠質細胞形態學研究的完整Golgi-Cox染色體系

使用手冊中文版

PK401/PK401A

僅用于體外研究

不能用于診斷或其它用途

I.介紹

Golgi-Cox浸染法是研究神經元和膠質細胞正常和非正常形態zui有效的方法之一。使用Golgi技術，在藥物處理過的動物腦中和因神經疾病死亡的病人腦中發現了神經樹突和樹突微小的形態改變。然而Golgi染色法的不可靠性且費時已成為這種方法廣泛應用的障礙。

FD Rapid GolgiStain^TM Kit(FD快速高爾基染色法)是根據Ramón-Moliner，Glaser和Van der Loos所闡述的方法原理設計的。該試劑盒不僅極大地改進并簡化了Golgi-Cox技術，而且被證實在顯示神經元和膠質細胞，尤其是樹突棘的形態細節極為靈敏可靠。啟維益成的FD Rapid GolgiStain^TMKit已被廣泛測試并用于數種動物腦及去世病人的腦。

結果圖片

II.試劑盒組分

室溫保存

III.需要但未包括在試劑盒里的物品

1.雙蒸水或Milli-Q水

2.塑料/玻璃管或瓶

3.組織學耗材：

   明膠包被的顯微鏡載玻片（Cat.#PO101）

   蓋玻片

   染色罐

   乙醇

   二甲苯

   樹膠封片劑Permount?

   光學顯微鏡

IV.安全操作注意事項

1.FD Rapid GolgiStain^TM Kit僅用于體外研究，不能用于診斷或其它應用。

2.試劑盒所包含有試劑是有毒的，吸入或接觸皮膚是有害的，如果吞咽可能是致命的。不要用嘴吸。避免吸入和接觸皮膚和眼睛。如果接觸，立即用大量的水沖洗并求助醫生。

3.在化學通風櫥下完成實驗。操作這些試劑時須穿戴合適的防護服，手套和眼睛和面部防護罩，完成實驗之后把手*沖洗干凈。

V.組織制備

使用此試劑盒前必須仔細閱讀以下說明??！

&&所用容器（為塑料材質）必須用蒸餾水沖洗干凈。

&&當溶液A和溶液B存在時不能使用金屬器具。

&&保持容器密封。

&&用溶液A和溶液B處理的組織和切片，應該避光。

&&除非特別指出，以下流程需在室溫下完成。

1.殺死動物之前對實驗動物進行深度麻醉。應盡快地從顱骨中取出動物的腦（或死去病人的腦），但操作時必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

注意

&&除非*必要，不要對動物進行灌注。如果確實需要對動物進行灌注（用4%的多聚甲醛處理不要超過5分鐘），一定不要對組織進行后固定處理。

&&體積較大的腦部樣本包括大鼠腦部應該用鋒利的刀片切成大約10mm厚的塊狀。重要提示！

2.用雙蒸水或Milli-Q水快速沖掉組織表面的血液。

3.把組織浸泡在由溶液A和B等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周*。浸泡6個小時以后或次日更換新的浸漬液。

*對于大多數情況浸泡2周是足夠的。然而，不同的組織類型及組織的大小不同可能需要延長或縮短浸泡時間來達到*效果。對于每種類型的組織的浸泡時間應該通過試驗獲得，但是對于大多數組織浸泡3周是足夠的。注意，延長浸泡時間可能增加染色背景。

注意

&&溶液A和溶液B的混合液至少在用之前24小時配制，并不能攪拌。

&&采用以上方案則不會產生沉淀是關鍵的。

&&制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長達一個月。

&&每m³待研究組織至少用5ml浸泡液。注意用較少的浸泡液可能降低染色的靈敏性和可靠性。

&&為取得*結果，在浸泡期間每周兩次對裝有組織的容器可輕輕地左右旋渦（一定不要晃動?。酌腌?。

警告

溶液A和B （含有升Hg，重鉻酸鉀和鉻酸鉀）接觸皮膚是有毒的，如果吞咽可能是致命的。實驗應該在化學通風櫥中完成。當操作這些試劑時應穿戴防護服，手套和防護面具/眼鏡。不要把溶液A和B的廢棄物倒進水槽中！把溶液A和B的廢棄物收集起來放到一個瓶子中，致電安全辦公室或有執照的專業廢物處理服務的部門處理些材料。

4.轉移組織到溶液C中室溫黑暗至少72小時（可長達1周）。24小時后或次日至少更換一次溶液。

5.在-20℃到-22℃的條件下用冷凍切片機將組織切成100-200 um厚的薄片（進行切片之前請仔細閱讀第4和5頁的信息）。也可用其它型號的顯微鏡薄片切片機包括滑動切片機和振動切片機（具體細節參看第4和5頁）。用樣本回收器（試劑盒提供）把樣本轉移到含有溶液C（試劑盒所提供的滴瓶是方便溶液C滴到載玻片上）的明膠包被的顯微鏡載玻片上（Cat#PO101）。載玻片上多余的溶液用吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風干（不能用電風扇或電熱板使其干燥）。為取得*結果，應盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中，室溫黑暗條件下zui長可保存3天。

注意

&&為避免組織受冷凍切片機的損害，并盡可能地保持細胞形態學，組織在進行冷凍切片之前應快速冰凍。比如，組織應按以下描述盡可能地快速冰凍：把組織放在一個塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的異戊烷中預冷（為取得*結果，溫度應保持在-70℃以下并且浸入過程用時1分鐘，越慢越好）。組織*浸入異戊烷之后，使組織在異戊烷中浸幾秒鐘，然后再放置干冰上1分鐘以確保組織能很好地冰凍。進行切片之前不要讓組織融化。

&&切片機的型號可能會有不同，但所用的型號確保能切厚的切片（比如100 um）。

&&如果冰凍切片機只有一個溫度設置，那么在進行切片之前把溫度設置在-22℃至少4個小時。如果有兩個溫度設置，那么設置槽內溫度比樣本溫度低1℃。請注意大多數情況下-22℃是*的溫度，然而，為了更順利地切出切片并沒有破碎，不同型號的切片機和不同的組織可能需要更高或更低的槽內溫度。

&&對于用冰凍切片機切片，以下幾點提示是有益的：1）用蒸餾水把組織固定于樣本盤上，但必須確保組織沒有融化（可以在干冰上完成）。組織可以被固定在任何類型的組織冰凍介質上包括OCT，但要避免切斷介質。不要在OCT中包埋組織，如果組織確實需要包埋，用TFM替代OCT。2）組織固定到樣本盤后，放置組織于干冰上10分鐘，然后立即把固定有樣本的樣本盤安裝到冰凍切片機上，等5分鐘之后進行切片。3）切好的一些切片（不要使用防卷板），如果組織溫度過低比如切片顯示出與刀片平行的裂縫，先等幾分鐘再進行下一個切片，否則可繼續切。

&&浸泡的腦可用瓊脂糖或明膠包埋然后用冰凍切片機切片。然而收集切片時（充滿切片槽），必須使用溶液C。否則切片易干燥裂紋。

&&如果用滑動切片機切浸泡的組織，樣本盤和刀片都需維持在較低的溫度（0℃以下）按照操作手冊的描述切片固定在含有溶液C的載玻片上是重要的。

VI.染色步驟

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

1.用雙蒸水或Milli-Q水沖洗切片兩次，每次4分鐘。

2.把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的雙蒸水或Milli-Q水組成的混合液中10分鐘。

比如：溶液D          10ml

            溶液E          10ml

            雙蒸水          20ml

注意

&&工作液現配現用，每100ml工作液zui多用于100張切片（比如小鼠腦），根據切片的大小。

&&盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發。

&&為取得*結果，孵育期間應頻繁攪拌工作液。

3.用蒸餾水或Milli-Q水沖洗切片兩次，每次4分鐘（蒸餾水應頻繁更換新的）。

4.用結晶紫或硫堇對切片進行復染（可選步驟）。

注意

&&對于復染，延長步驟3的時間，比如用沖洗4次每次5分鐘代替原來的沖洗2次每次4分鐘，或者更長的時間。

5.在50%，75%和95%的乙醇中對切片進行脫水，每個濃度梯度脫水4分鐘（不要跳過任何一個步驟）。

6.然后在無水乙醇中對切片進行脫水，4次，每次4分鐘（不要延長時間）。

7.在二甲苯中透明，3次，每次4分鐘，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片。

注意

&&蓋玻片之前切片可以暫時存于二甲苯中幾個小時。

&&為取得*結果，用未稀釋的封片劑。

&&用Golgi染色的切片無論何時都應避光保存。