博蕾德實驗技術服務指南

Western Blot 實驗服務檢測

樣品處理及保存

1）懸浮細胞樣品：

 把細胞及培養液一起收集到15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

2）貼壁細胞樣品

• 胰酶消化：用胰酶將細胞消化后，收集到15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。
• 細胞刮子收集細胞：對于某些蛋白（即對胰酶比較敏感或者實驗特殊要求，如E-Cadherin不易用胰酶消化后進行WB檢測），直接用細胞刮子刮下細胞，收集到EP、15ml或者50ml離心管中，1500rpm離心3min，棄去上清；加入PBS輕輕吹打，1500rpm離心3min，棄去上清；反復3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

3）動物組織樣品：

    取下合適的動物或者人的組織樣品后用預冷的PBS或者生理鹽水漂洗，盡量除盡殘留血液，用濾紙把多余PBS吸取干凈。把組織分成約50mg大小（依據實驗目的需要進行調整），用錫紙分別包裝好或者用凍存管裝好，于-80度或者液氮中保存。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

4）植物樣品：

    取得待測植物樣品后，用蒸餾水把泥土漂洗干凈，用濾紙把多余水分吸取干凈，分裝成合適大小于-80度或者液氮中保存。在避免凍融的情況一般保存1年，建議盡快檢測。

5）細菌樣品：

細菌培養完成后，10000rpm離心5min收集細菌，加入PBS吹打，10000rpm離心5min，棄去上清；反復3次，棄去上清后于-80度或者液氮凍存待用。

客戶提供資料

• 新鮮或正確保存的樣品：細胞＞1×10⁷；組織＞30mg；細菌濕重＞1mg；植物＞100mg；血清＞50ul等；樣品蛋白濃度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/樣品。
• 若要檢測磷酸化蛋白，請在3個月內進行。長時間保存樣品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而檢測不到磷酸化條帶。
• 提取胞漿、胞核蛋白的樣品應盡量采用新鮮樣品，凍存樣品提取的胞核蛋白可能會減少。
• 目的蛋白一抗，我公司可代購。
• 陽性對照樣品（盡量提供）；

結果提供

• 預實驗曝光結果（膠片及掃描圖），預實驗采取一至兩個一抗稀釋度；
• 正式實驗曝光結果（膠片及掃描圖）；
• 完整實驗報告；
• OD值分析報告（可選）。

收費標準

以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本按8個樣本收費，歡迎詢價詳談。

ELISA 實驗服務檢測

樣品處理及保存
 1）血清：
     室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
 2）血漿：
    應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
 3）尿液：
    用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
 4）細胞培養上清：
    A、檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/ 分）。仔細收集上清。
    B、檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并 放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
  5）組織標本：
    切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的細胞/組織裂解液，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

客戶提供資料

• 提供液體類標本（血清、血漿、尿液、腦脊液、細胞培養上清等）和組織標本。（注：當天收集待檢測的標本，儲存于4℃；周期收集樣本待檢測的標本，保存于-70℃，避免反復凍融）。
• ELISA 試劑盒

結果提供

詳細實驗流程（包括標準曲線、樣品的吸光值、濃度等），保證檢測結果準確、客觀、可信，但不能確保一定要得到某特定結果。

實驗費用及時間：

根據樣品數目進行報價（具體事宜請咨詢）。ELISA實驗一般3-5個工作日。

流式細胞術檢測服務

樣品制備參考：

A.     直接標記抗體（FITC標記抗體）：
(1) 收集1×10⁶個細胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞，800rpm離心5min。
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×10⁵個細胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測即可。
(4) 用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。

B.     未標記抗體間接免疫熒光標記法：
(1) 收集2×10⁶個細胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次，800rpm離心5min。
(2) 用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細胞，800rpm離心5min；
(3) 用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。
(4) 加入飽和劑量未標記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細胞，800rpm離心5min，洗去未結合一抗，重復一次。
(5) 加入熒光標記（FITC）標記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。
(6) 加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細胞；固定待測。
(7) 流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。
C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：
(1) 待測樣本制成單細胞懸液，然后2000轉/分離心5分鐘，棄上清。
(2) 用4℃預冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。
(3) 調整細胞濃度為10⁶細胞/毫升，取1毫升細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。
(4) PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。
注：本方法僅供參考，如有其它要求，請在送樣前說明

客戶提供：
1) 單個細胞：1~2×10⁶ 個細胞左右；來源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；來源于人、小鼠、大鼠或其它

3）抗體（熒光素標記）或檢測試劑盒

結果提供：

l實驗方法、步驟、所用試劑、儀器等。

流式實驗數據。

實驗費用及時間：

根據樣品數目和檢測項目進行報價（具體事宜請咨詢）。流式實驗一般為3-5個工作日。